液相方法開發指南-反相色譜

前言

近數年國內藥物研發風生水起，十分火爆，而藥物研發的分析領域必然經常需要開發HPLC檢測方法， HPLC較常用的是反相色譜。本文力求從實戰中闡述理論，在實戰中總結經驗，使得看完本文的讀者就能對自己實際工作中的方法開發有一個初步的構想。R-HPLC方法開發一般包含四大塊的內容：檢測波長、色譜柱、樣品處理、流動相。下文將主要從這四個方面闡述在方法開發中如何選擇上述參數。

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檢測波長

1.1閑述

紫外檢測器是液相中常用的檢測器，絕大部分藥物在該檢測器中有響應，所以本文僅闡述使用紫外檢測器如何確定檢測波長，其他檢測器的使用將另行說明。

1.2常見做法

目前常見的做法是用選定的稀釋劑或者某個溶劑將樣品溶解，然后在紫外光譜儀中進行全波長掃描，得到各組分的光譜，并確定方法的檢測波長。

很遺憾的說，上面的做法不正確。我們可以想象，當組分進入檢測器時，它是處在流動相中的，也就是說各組分在HPLC中的光譜表現是在流動相中的光譜表現。紫外吸收光譜有一個術語叫“溶劑效應”，是指受溶劑的極性或酸堿性的影響，使溶質吸收峰的波長、強度和形狀發生不同程度的變化。這就意味著如果溶劑與流動相不一樣，則上述的光譜和各組分實際在HPLC中的光譜很可能是不一致的。比如某些易解離化合物在不同pH值的溶劑中，大吸收波長不一樣。

1.3如何確定檢測波長

使用二極管陣列檢測器（開發方法的時候優先選擇該檢測器）按照確定的方法進樣分析，獲得各組分的光譜圖，檢測波長一般選擇主成份的波峰或者波谷處。因為在波峰或者波谷處較為平坦，波長的少許偏差響應相差不大，方法在波長這一塊的耐用性較好，而在坡上則正好相反。如果是多組分含量測定，比如復方制劑的含量測定，可以使用二極管陣列檢測器，分別調取不同組分的大吸收波長響應數據。

在有關物質的檢測波長選擇中，有一種常見做法是將各個組分的光譜圖疊在一起，選擇交叉處，因為該處的各組分響應接近，即校正因子將都接近1。這種做法并不提倡，因為交叉處大多出于坡上，檢測波長的變動將帶來響應值的巨大變化，方法的耐用性非常差，甚至可能導致各組分的響應非常不穩定。建議波長選擇主峰的波峰或者波谷，因為有關物質大部分結構與主成份類似，光譜行為接近，如有結構與主成份相差較大，響應也相差很大，可以單獨制定控制方法（如外標法）。

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色譜柱

應根據進樣量、樣品性質、儀器狀態、其他組分和流動相等情況選擇相應的色譜柱。

2.1進樣量

如有關物質方法，各組分響應較弱，為滿足靈敏度的要求，進樣量較大，則需考慮色譜柱應滿足荷載的要求，避免進樣量大導致的柱過載使主峰展寬變形。一般這種情況大多選用大載碳量的25×0.46cm或更大規格柱，盡可能提高柱荷載。與此相對，含量測定方法一般進樣量較小，為減少分析時間可以選擇較短的色譜柱。

2.2樣品性質

反相色譜使用的色譜柱大多是烷基鍵合硅膠，如C18、C8、苯基柱等。硅膠上有硅羥基，硅羥基會電離成硅氧負離子。如果供試品為堿性化合物，如鹽酸厄洛替尼，弱堿強酸鹽，則厄洛替尼除了會與鍵合相產生“相似相容”的反相色譜保留作用外，還會與硅氧負離子產生離子色譜的保留作用，即“二次保留”，導致厄洛替尼峰拖尾。

解決堿性化合物拖尾有兩個辦法，一個是在流動相中加入掃尾劑，相應內容見“流動相”。另一種方法是選擇“封尾（也稱封端）”處理的色譜柱。所謂封尾，是因為鍵合相一般體積較大，C18、C8、苯基等，因空間位阻使得硅膠上硅氧負離子不能*被鍵合，所以用小分子烷烴與硅膠上殘余的硅羥基鍵合，減少硅氧負離子的數量。一般在開發堿性化合物液相方法時選擇封尾處理的色譜柱，具體封尾柱的型號見供應商說明書。

酸性和中性化合物選擇色譜柱不用考慮硅氧負離子的影響。

2.3儀器狀態

選擇色譜柱時，還需考慮儀器是否匹配，選擇小粒徑或小口徑色譜柱，應評估儀器的大耐受壓力是否符合要求。如選擇快速分析柱（短、小粒徑、小口徑），應考慮柱外死體積引入的峰展寬，這種情況下建議選擇同一廠家的儀器與色譜柱，避免接頭不匹配增加死體積。

2.4其他組分

如膠囊的溶出檢測中，使用C18柱如果發現多次檢測后主成分峰變形，一般是因為膠囊殼中存在強保留組分，可以選擇另一種保留機制的色譜柱如氰基柱或氨基柱等。不同類型鍵合相保留機制各有不同，篇幅有限，另行說明吧（又挖個坑）。比如苯環上的細微差別，如多了個鹵素，C18柱分不開，可以選擇苯基柱，苯基柱對于苯環上細微差別有良好的分離效果。某些組分分離效果非常差，可以考慮換一個型號的色譜柱，比如從島津的ODS-2換成安捷倫的XDB-C18，不同型號的色譜柱因為工藝的差別選擇性也是有差別的，這沒有規律，只能是通過實驗來確認適用的色譜柱。

2.5流動相

應選擇與擬定流動相匹配的色譜柱，增加色譜柱使用壽命。如流動相含0.1%磷酸，就應選擇耐酸柱；反之如流動相pH較高（＞7），應選擇耐堿柱。具體哪些型號色譜柱耐酸或耐堿，見供應商說明書。

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樣品處理3.1稀釋劑選擇

稀釋劑不是只把樣品溶解就可以了，需要考慮“溶劑效應”，此溶劑效應與上文紫外光譜的溶劑效應不是同一個含義。溶劑效應的具體概念及詳細分析請見拙著《論液相色譜的溶劑效應》，不再贅述。選擇稀釋劑時，稀釋劑在滿足溶解供試品的前提下，應盡可能與流動相性質接近，在有機相比例、pH值等方面，但是一般很少選擇流動相作為稀釋劑，因為流動相配制較為麻煩，選擇流動相作為稀釋劑增加了工作量；還有就是很多流動相中含有緩沖鹽，如果選為稀釋劑，供試品溶液在進樣器中產生高壓鹽析現象，固體鹽顆粒會損壞進樣器。稀釋劑一般選擇同初始比例的有機相-水系統。如果不溶解，需要用其他溶劑溶解的話，建議使用前述的有機相水系統稀釋10倍以上。絕不能直接用其他溶劑溶解，然后進樣分析，因為很可能產生溶劑效應和樣品析出堵塞儀器。易解離化合物可以在稀釋劑中加入鹽酸或者氫氧化鈉助溶。

補充說明，一般保留時間短的組分容易出現溶劑效應，減少溶劑效應可以采取的措施有減少進樣量、增強保留、改變稀釋劑、優化流動相。優化流動相是因為溶劑效應是稀釋劑和流動相相差性質較大導致的結果，也就是二者的相互作用導致的，所以可以通過優化流動相來消除溶劑效應。

3.2供試品濃度

有關物質方法應考慮方法的靈敏度，一般主成份峰的響應值應不低于1000，并將供試品溶液稀釋一萬倍后信噪比應不低于10。含量測定方法應考慮主成分峰在線性范圍內，不能分離的雜質峰在規定濃度下應可以忽略不計。

3.3供試品處理方法

如果供試品的處理方法畢竟特殊，還需要在質量標準中規定特殊的處理方法，則需要對供試品的處理進行相應的研究。比如片劑的含量測定，直接投片、研成細粉、除去包衣再研成細粉、超聲及時間、震搖及時間、濾膜吸附、離心等等。這些處理方法都需要進行相應的研究，以保證樣品的處理符合檢測的需要。比如說片劑含量實際是100%，而檢測結果卻是90%，色譜條件沒有問題，問題出在供試品處理時提取不*。

3.4 衍生化

某些情況下樣品需要衍生化才能滿足質量控制的要求，如保留太弱、沒有響應、異構體無法分離等。

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流動相

4.1流動相的種類

反相色譜的流動相主要是兩大類：水相和有機相。水相主要分為兩種：純水和緩沖鹽；有機相常用的是乙腈和甲醇，其他還有乙醇、異丙醇等。

4.1.1 什么情況下用純凈水

供試品和主要雜質都是中性化合物（即不會電離或者不易電離）的情況下，流動相可以用純水-有機相系統，這種情況不多，所以大多數都用了緩沖鹽。

4.1.2  什么情況下用緩沖鹽

供試品或主要雜質為易解離化合物，如鹽酸厄洛替尼、帕瑞昔布鈉等一看就是能電離的，根本不用考慮純水，流動相需要使用緩沖鹽。易解離化合物的相關內容見《易解離化合物的pKa、離子型、分子型及其HPLC保留特征》，緩沖鹽使用的詳細內容見拙著《方法開發緩沖鹽選擇指導原則》，本文不再贅述。

4.1.3 如何選擇有機相

一般是根據組分的分離情況、截止波長、壓力等因素選擇有機相。比如甲醇和乙腈，二者的性質不一樣，甲醇有氫鍵，乙腈是偶極矩，在組分間的選擇性不一樣，甲醇分不開的組分可能乙腈能分開，乙腈分不開的組分可能甲醇能分開。低波長下如205nm一般應選擇乙腈，乙腈的截止波長較低，在低波長下基線較平坦，此時不應選擇乙醇等溶劑。乙腈作為流動相產生的壓力一般也小于甲醇、乙醇等溶劑，如果超過系統允許大壓力的風險較高，應選擇乙腈作為流動相。流動相常用有機溶劑截止波長親們需要去了解，方法選定的波長應遠大于流動相的截止波長。

4.2 如何確定流動相比例和梯度

有兩種做法，一種是設置一個60分鐘有機相比例從5%到100%的梯度，并根據此梯度下各組分的保留的情況決定下一步的優化策略。不過實際工作中這么做耗時太久，推薦做法是等度逐漸降低有機相比例確定各組分的保留情況，并根據等度研究的結果確定是否采用梯度及梯度情況。

舉例如下：需要建立一個有關物質檢測方法，有A、B、C、D、E5個組分，極性依次增大（分析人員應能做到看化合物結構式就能判斷其極性的相對大小，這對有機化學的功底有一定的要求），即在反相色譜中保留依次減小。首先用80%有機相分析A， k值為1；分析B，無保留。則CDE三個保留更弱的組分在該條件下沒有必要進樣。

因為B無保留，所以有機相應直接減少20%，改變條件為60%有機相，分析B，k值為0.5；此時需要注意一個反相色譜的一個規則“三倍規則”，即有機相比例減少10%，保留值增加2-3倍。該規則可以準確預測中性化合物隨有機相比例變化的保留情況，易解離化合物因為保留較為復雜，可能會有偏差。改變條件為50%有機相，分析C……分析E的時候有機相比例30%，k值為1。

上述的研究就讓我們對5個組分的保留有了一個直觀的了解，必須走梯度，梯度下限應不大于30%，上限應不小于80%，我們可以設置梯度為25分鐘從30%升到80%保留5分鐘，然后確定各組分在該梯度下的分離情況，必要的話進行調整。這么做的好處是速度快，一般來說順利的話一個上午可以完成各組分等度研究，下午確定梯度分離情況，一天完成一個有關物質方法的開發；另一個好處就是在等度研究時就可以確認各組分分離情況了，很快就能發現難分離組分。

4.3添加劑

  4.3.1  掃尾劑

上文說到的堿性化合物因硅氧負離子的二次保留導致的拖尾，常用二乙胺、三乙胺等小分子有機胺類化合物飽和硅氧負離子，使其不能與目標化合物產生二次保留。二乙胺、三乙胺一般被稱為“掃尾劑”。不建議在流動相中使用掃尾劑，因為使用之后流動相容易變質，噪音變大，且易出鬼峰。一般情況下使用封尾處理的色譜柱可以達到相同的效果。

    4.3.2  離子對試劑

如供試品中有強離子化傾向的組分，保留非常弱，為了增強其保留，可以在流動相中加入相應的離子對試劑如氫氧化四丁基銨、十二烷基硫酸鈉等。它的原理就是流動相相中的離子對試劑的非極性基團與反相鍵合相結合，其離子化基團與強離子化組分陰陽離子相互吸引，增強強離子化組分的保留。如小分子強堿性化合物，如在流動相中加入十二烷基硫酸鈉，十二烷基與色譜柱的C18結合，硫酸陰離子與該化合物形成離子間的保留，極大增強了該化合物的保留。

離子對色譜中即有反相色譜的保留機制，又有離子色譜的保留機制。它的保留呈現以下的規律：強離子化組分的保留隨離子對試劑的濃度增加而增加，隨pH值的變化而變化，即可以通過調節離子對試劑的濃度和pH值改變強離子化組分的保留。其他中性組分隨離子對試劑的濃度增加保留可能略有減少，反離子組分的保留極大減少。

加入離子對試劑的缺點是流動相容易變質，污染色譜柱，平衡時間非常長，基線較差等。所以除非有上述存在強離子化傾向的組分，一般我不愿意使用離子對試劑。

   4.3.3 手性添加劑

可以在流動相中加入手性添加劑實現在反相色譜中分離手性異構體，當然這是比較冷門的做法，有興趣可以了解，一般不大用。使用手性色譜柱分析手性異構體是常用的方法。

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其他

方法開發時應選擇二極管陣列檢測器，在方法開發過程中考察各組分的峰純度，獲得各組分的光譜圖。

方法確定后應進行初步的驗證，如降解試驗，確認降解產物是否能夠分開。降解試驗的做法見拙著《分析方法學驗證技巧與重點》。

方法開發是一個持續的過程，應在工作中持續評估方法的有效性和合理性。如本人曾經有一個項目在很后期才發現片劑經研磨后含量測定的結果低了3個點，然后將供試品處理改成直接投片。